HL-60 人早幼粒白血病細(xì)胞如何培養(yǎng)？

HL-60該細(xì)胞是一株早幼粒細(xì)胞。 外周血白細(xì)胞來(lái)自一位患有急性粒-單核細(xì)胞白血病的36歲白人女性。 HL-60 自發(fā)分化，丁酸鹽、次黃嘌呤、佛波醇肉豆蔻酸(PMA,TPA)、DMSO(1% to 1.5%)、放線菌素D和視黃酸可以促進(jìn)分化。 細(xì)胞表現(xiàn)出吞噬活性，并對(duì)趨化刺激有響應(yīng)。致癌基因myc表達(dá)陽(yáng)性。

致瘤性

Yes, in nude mice (subcutaneous myeloid tumors). Yes, in semi-solid media.

表達(dá)標(biāo)記

complement, expressed;Fc, expressed

基因表達(dá)

tumor necrosis factor (TNF), also known as tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha, TNF alpha), after stimulation with phorbol myristic acid, myc+

保藏機(jī)構(gòu)

ATCC; CCL-240

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備

1） 準(zhǔn)備RPMI-1640（含NaHCO3 1.5g/L推薦iCell-128-0002 或者GIBCO,貨號(hào)31800022, 添加NaHCO3 1.5g/L,或者ATCC-formulated RPMI-1640 Medium, Catalog No. 30-2001  ATCC 改良）培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2).培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mLwan全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，wan全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8mlwan全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來(lái)終止消化。

3. 輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說(shuō)明書(shū)要求配置的新的wan全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

3）細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

下面T25瓶為例；

1. 細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過(guò)程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來(lái)決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10^6~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ，按每1ml凍存液含1×10^6~1×107個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱(chēng)、代數(shù)、日期等信息。

3. 將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過(guò)夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

SK-MEL-1人皮膚黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)方式？

貨號(hào)：WS0029H

培養(yǎng)條件：MEM培養(yǎng)基；10%胎牛血清；1%雙抗

運(yùn)輸和保存

干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞

（1）1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80度冰箱保存過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。

（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。

細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有黑點(diǎn)怎么辦？

首先，要肉眼觀察培養(yǎng)基是否混濁，然后，在鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)，黑點(diǎn)是否游動(dòng)。如果細(xì)胞被污染，微生物則會(huì)大量繁殖，培養(yǎng)基就會(huì)迅速變黃、變混油。污染包括細(xì)菌污染、支原體污染等。如果在鏡下現(xiàn)察細(xì)胞，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，與黑點(diǎn)出現(xiàn)前相比，沒(méi)有任何變化，那么，黑點(diǎn)的出現(xiàn)可能與以下幾種情況有關(guān):

(1)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)老，破碎的細(xì)胞殘骸:

(2)配制培養(yǎng)基的pH值偏高，不直細(xì)胞生長(zhǎng);

(3)培養(yǎng)原代細(xì)胞中出現(xiàn)小黑點(diǎn)，可能是原代組織中的雜質(zhì)，多次傳代可以消除;

(4)血清等級(jí)不足以維持細(xì)胞良好的生長(zhǎng)，更換高等級(jí)的胎牛血清。

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